【青蒿素问世50年】中医药献给世界的礼物——青蒿素研究历程

     

临危受命加入军工项目开发抗疟药物
 

        1961年5月，美越战争爆发。越南军队伤病员比例，除1968年第一季度以外，病员均远超伤员，病员中大多数是患疟疾。1964年越共中央领导向我国党中央提出，希望帮助其解决部队受疟疾困扰这一难题。我中央领导回应：解决你们的问题，也是解决我们的问题。为此，党中央指示有关部门要把解决热带地区部队受疟疾侵害、影响部队战斗力和军事行动的问题作为紧急援外战备任务立项。研制新型防治疟疾药物，成为当时中国军队医药科技工作者的一项重要政治任务。

        由于任务的紧迫性和艰巨性，中国人民解放军总后勤部商请国家科学技术委员会，会同国家卫生部、化工部、国防科学技术委员会、中国科学院六部门，于1967年5月23日在京召开“疟疾防治药物研究工作协作会议”，通过军民合作，组织所属科研、医疗、教学、制药等单位，讨论确定三年研究计划，开发防治疟疾药物，并组建了领导小组及其办公室。由于这是一项紧急军工项目，为保密，以开会日期为代号，称之“523”任务。

         自此，先后有7个省市和相关部属单位全面开展了抗疟药物的调研普查和筛选研究，到1969年筛选的化合物和包括青蒿在内的中草药有万余种，但未能取得理想结果。

         1969年1月21日，全国“523”办公室鉴于当时的困境，由主任白冰秋、副主任张剑方及田辛等到访卫生部中医研究院，商请该院能参加此项政治任务。中医研究院接受任务后交由所属的中药研究所（以后，简称中研院中药所）来完成，并任命屠呦呦为中药抗疟科研组组长。
 

三个关键奠定青蒿素发现基础
 

         接受抗疟药物研究任务后，屠呦呦首先从本草研究入手，广泛收集、整理历代医籍，查阅群众献方，请教老中医专家。用了3个月的时间，收集到包括内服、外用，植物、动物、矿物药在内的2000多个方药，作为以后研究工作的铺垫，并在此基础上精选编辑了包含640个方药的《疟疾单秘验方集》，以中医研究院革委会业务组的名义油印成册，于1969年4月送交全国“523”办公室，希望能转送相关单位参考。
 

初期的实验研究
 

        之后，屠呦呦就开始进行实验研究。说是课题组，其实初期仅有屠呦呦一人，最先是配合其他“523”研究组研究，为解决具有抗疟活性的常山碱所致呕吐的副作用，寻找减毒的合适配伍中药。之后随着余亚纲的加入，1969年5月起，他们开始制备多种中药的水提取物、乙醇提取物，送请中国人民解放军军事医学科学院（以下简称236）进行抗疟活性筛选，至6月底送样品50余个，其中，发现胡椒提取物对鼠疟模型疟原虫抑制率达84%。1969年7月，时值海南疟区流行季节，全国“523”办公室希望中研院中药所参与任务的科研人员去现场体验实际情况，并提出在上半年筛选样品中对鼠疟抑制率较高的胡椒及辣椒加明矾可带去做临床疗效观察。中研院中药所的屠呦呦、郎林福、余亚纲全组3人前往海南。
 

       在海南疟疾疫区的临床验证发现，尽管胡椒和辣椒加明矾的多种制备样品对鼠疟实验治疗的抑制率达80%以上，但对疟疾病人只能改善些症状，不能使患者的疟原虫转阴。任务结束后，屠呦呦被广东省“523”办公室授予“五好队员称号”奖状。
 

       1970年9月，屠呦呦与余亚纲讨论进一步扩大筛选范围，由余亚纲负责矿物和动物药筛选；屠呦呦负责植物药的筛选。
 

发现青蒿抗疟活性的化学部位
 

        筛选工作离不开动物模型，在军事医学科学院微生物流行病研究所等的帮助下，中药所建立了鼠疟动物模型。至1971年9月初，他们高强度地筛选了100余个中药的水提取物和醇提取物200余种，但结果不理想。带着问题，屠呦呦再次请教中医专家，并对以往研究过的几个药物的历代文献进行重新梳理。如青蒿，在中国的应用已有2000多年的历史，《神农本草经》就有记载，青蒿治疗疟疾则始于公元340年间的东晋葛洪《肘后备急方》，之后，宋《圣济总录》，元《丹溪心法》，明《普济方》等著作均有“青蒿汤”“青蒿丸”“青蒿散截疟”的记载。明李时珍在《本草纲目》中，除收录了前人的经验外，还载有治疗疟疾寒热的实践，清《温病条辨》《本草备要》，以及民间都有青蒿治疗疟疾的应用。在服法上，一般均作汤剂。在反复研读文献过程中，葛洪《肘后备急方》中“青蒿一握，水两升渍，绞取汁，尽服之”，治疗寒热诸疟的描述，给了屠呦呦新的启迪。古人以“绞汁”的用法令她悟到青蒿中的有效成分跟提取温度也许有关系，之前一般中药常用水煎煮或乙醇提取，但结果都不好，并且想到只有嫩的枝叶才会绞出汁来，这是否还涉及药用部位的问题。后来实验证明，确实只有青蒿叶子才含有抗疟活性成分——青蒿素，占大量份额的坚硬茎秆中青蒿素的含量是极低的。于是又重新设计了以低温提取的研究方案，果然发现青蒿乙醚低温提取物对鼠疟模型有较高的效价。1971年10月4日，药物研究序号为第191号（又简称为91#）的青蒿乙醚中性提取物，展现了令人振奋的结果，对疟原虫的抑制率达100%。此后，屠呦呦及其课题组又不断完善提取、精制方案，制备样品，并在猴疟模型上证实乙醚中性提取物的抗疟活性。1972年3月8日，屠呦呦在南京召开的抗疟药研究“523”内部会议上，报告了青蒿及其乙醚中性提取物对鼠疟、猴疟具有良好抗疟作用的发现。会后，全国“523”办公室要求中研院中药所当年将此青蒿有效提取物，带到海南疟区现场，观察对病人的抗疟疗效。
 

临床试用有效
 

         要进行临床研究，就必须先制备大量的青蒿乙醚中性提取物，用以临床前的安全性等试验和制备临床观察用药。短时间内提取大量的青蒿提取物在当时是很困难的，屠呦呦课题组因陋就简、甚至买来盛水的大缸充当提取锅用，终于得到了足够的青蒿乙醚中性提取物。但在进行临床前毒性试验时，却出现了问题，在个别动物的病理切片中，发现了疑似的毒副作用。因此，药理学的同事认为需要进行反复多次试验，当确证无毒后，才能上临床。综合分析青蒿古代的用法又结合实验动物的表现，屠呦呦认为疑似的毒副作用不至于发生。为此她当机立断，给领导打报告，愿以身试药，经领导研究，同意屠呦呦的申请。于是屠呦呦及课题组其他两位同事响应，共三人住进了医院，按照人体探路试服方案，在严密监控的情况下，于1972年7月，开始了青蒿提取物的人体试验。经一周观察，未发现该提取物对人体有明显毒副作用，三位受试者情况良好。8月初，又增添做了五例人体试服，亦未发现疑似的毒副作用，才同意上临床。于是屠呦呦亲自携药赶赴海南昌江疟区。屠呦呦亲自给病人喂药，以确保用药剂量，并守在床边观察病情，测量体温，详细了解血片检查后的疟原虫数量变化等情况。最终完成了海南疟区间日疟11例，恶性疟9例，混合感染1例的21例临床抗疟疗效观察，取得疟原虫全部转阴的满意结果。还同时在北京302医院验证了9例，亦均有效。

      1972年11月20～30日在北京召开的全国各地区“523”办公室主任座谈会上
，屠呦呦报告了青蒿乙醚中性提取物首次临床30例抗疟全部有效的结果，引起了与会同道的极大关注。会后，山东、云南等地还去人、去信询问详情，屠呦呦及其课题组都做了积极回应。
 

       青蒿提取方法的创新、抗疟活性化学成分的获得，及临床试用有效，是发现青蒿素的关键。
 

卫生部中医研究院中药研究所的首创
 

       发现有活性的青蒿乙醚中性提取物后，屠呦呦及其课题组便开始进行有效成分的分离提取工作。1972年8月1日，屠呦呦曾在对青蒿乙醚中性提取物的化学分离中，经硅胶板层析，发现用硅胶分离的效果为好。在她到海南验证青蒿乙醚中性提取物临床疗效、暂离实验室时，由倪慕云主持工作。课题组不断地改进和完善提取分离方法和条件，进一步去粗存精。当年9月25日、9月29日、10月25日、10月30日、11月8日倪慕云、钟裕容、崔淑莲相继分得多个结晶。
 

         在完成青蒿乙醚中性提取物临床验证任务后，屠呦呦就立即投入到化学研究工作。和课题组讨论、比较分析了已得的化学单体。通过显色反应、板层析Rf值等鉴别异同，整合所分得的成分，并在鼠疟上评价药效。12月初，鼠疟试验发现，钟裕容、崔淑莲11月8日用硅胶柱分离得到的II号结晶有显效，小鼠口饲50毫克每公斤体重可使疟原虫转阴。首次以药效证实了从青蒿中获得的具有抗疟活性的单一化合物（当时称为“青蒿针晶II”或“青蒿素II”，后定名为青蒿素）。她们将1972年11月8日定为青蒿素的诞生日。这是青蒿素发现史上一个值得纪念的里程碑。
 

青蒿素抗疟的临床验证
 

        从1973年初到1973年5月，中研院中药所已提取获得青蒿素纯品100余克。屠呦呦将其一部分用于青蒿素的化学研究，一部分用于临床前的安全性试验，一部分制备临床观察用药，少部分留做备用。
 

       1973年第二季度，进行了青蒿素的一系列安全性试验研究：青蒿素试验剂量无论大或小，对猫的血压、心率、心律和心电均无明显影响；三批次犬的毒性试验，除个别犬出现流涎、呕吐和腹泻外，其他各项指标均正常，未发现明显毒副作用。
 

        慎重起见，这次也同样做了健康人的人体试验。在制定了详细人体试服计划后，于1973年7月21日~8月10日，四名科研人员参加了试服，结果未见明显毒副作用。
 

         青蒿素的动物及人体的安全性试验已经通过，意味着新一代抗疟药即将诞生。大家都对临床验证翘首以望。然而，青蒿素的临床验证却是一波三折。
 

         中药所的同事把青蒿素片剂送到海南现场后，由已经在那里工作的中研院医疗队着手临床观察。1973年8月10日~10月15日，用青蒿素治疗外来人口疟疾8例。实际是分两个阶段完成的，9月22日前，观察了青蒿素治疗外来人口恶性疟疾5例，因剂型影响，效果并不满意。经讨论决定，用青蒿素原粉直接装胶囊。赶在海南疟区现场观察季节结束前抓紧验证，以明确青蒿素的临床疗效。屠呦呦亲自动手，将该青蒿素装入胶囊，中药所业务负责人章国镇携青蒿素胶囊飞赴海南，9月29日抵达疫区现场，观察了3例外来人口间日疟，服药总剂量3.0克~3.5克。结果表明，药后平均31小时内体温复常，18.5小时血疟原虫转阴，全部有效，未见明显副作用。但因海南疟区现场观察季节结束，未能再找到恶性疟患者继续验证。这是青蒿素的首次临床试用，说明所得到的青蒿素是青蒿的抗疟活性成分。山东、云南等地也进行了临床验证。
 

青蒿素栓剂的问世
 

        1976年卫生部中医研究院中药研究所开始研究将青蒿素制成栓剂，1982～1984年直肠给药治疗358例恶性疟、105例间日疟取得满意结果。1985年6月16日卫生部药品审评委员会化学药分委会第一次审评会试评青蒿素栓剂，1986年10月获青蒿素、青蒿素栓剂新药证书。这是我国实施药品管理法以来，第一个批准上市的新药。
 

青蒿素化学结构的确定
 

        中研院中药所1972年首次从青蒿有效部位中分离提纯出有效单体青蒿素之后，屠呦呦及其课题组即着手青蒿素的化学研究。1973年一季度，已做了熔点、旋光度值与元素分析等，初步确定，无氮，有 ，-OH及CH3等基团，它与已有抗疟药中都含氮原子不同，是一种新类型化合物；同年4月，又进行了光谱分析等研究工作，确定了其分子式C15H22O5，分子量为282，并请中国科学院化学研究所和中国医学科学院药物研究所进行了复核。1973年9月20日，为了确定青蒿素的内酯结构，课题组对青蒿素进行硼氢化钠还原，获得了还原青蒿素（现称为“双氢青蒿素”），这为以后发展青蒿素衍生物打下了基础。
 

        鉴于青蒿素是倍半萜类化合物，得悉中国科学院上海有机化学研究所在这类化合物研究上有较好的经验和设备条件，1973年8月下旬，屠呦呦前往该所联系，希望开展协作。1974年1月上海有机所函复同意屠呦呦一人前往，拟由该所周维善教授主持，吴照华和吴毓林参加，共同合作。但屠呦呦因长期大量溶剂接触致中毒性肝炎而未成行。从1974年2月起，中药所先由倪慕云、后有钟裕蓉、刘静明、樊菊芬相继前往，共同协作进行青蒿素化学结构的研究工作。1974年2月倪慕云前往时，携带了青蒿素和双氢青蒿素样品及其相关技术资料，进行对青蒿素、双氢青蒿素的红外、MS、元素分析、NMR等图谱数据的复核，所得结果与北京已做的基本一致。
 

        1974年下半年，屠呦呦得知中国科学院生物物理研究所有新型X线衍射仪可作物质结构研究，商请他们参与青蒿素分子结构研究。1975年11月，中国科学院生物物理所李鹏飞等研究提出了青蒿素的相对构型，继而该所梁丽等以X线反常衍射法提出绝对构型。同月，屠呦呦与李鹏飞到上海有机所通报此情况，由该所周维善、吴毓林、吴照华等参与并确证：青蒿素是一个仅由碳、氢、氧3种元素组成的、具有过氧基团的新型倍半萜内酯，是与已知抗疟药的化学结构完全不同的新型化合物。
 

        1977年3月，由中医研究院上报卫生部批准，以“青蒿素结构研究协作组”名义、“一种新型的倍半萜内酯—青蒿素”为题，于我国《科学通报》的第3期上公开发表。
 

青蒿素衍生物的开发
 

        为了进一步发挥具有新化学结构类型抗疟药物青蒿素的优势，在构效关系研究和化学结构鉴定基础上，我国及时进行对青蒿素衍生物的研究开发。
 

       双氢青蒿素 1973年9月，屠呦呦研究团队在进行青蒿素化学研究过程中，发现青蒿素经硼氢化钠还原，其羰基峰消失、出现羟基，这个青蒿素的还原产物就是双氢青蒿素（时称还原青蒿素），分子式为C15H24O5、分子量为284，对鼠疟的作用强于青蒿素。1992年7月获双氢青蒿素和双氢青蒿素片剂新药证书，由北京第六制药厂生产，北京科泰新技术公司在国际市场销售，商品名“科泰新片（Cotexin）”。
 

        蒿甲醚 1976年初，在确定青蒿素结构后，同年2月，“523”办公室向中科院上海药物研究所下达了青蒿素结构改造的任务，由该所合成化学、植化、药理等研究室分工合作。在已有的青蒿素化学反应研究的基础上，1976年下半年，李英发现蒿甲醚、蒿乙醚均能较好抑制疟原虫的作用；由于蒿甲醚活性强、在油中溶解度大、化学性质较为稳定，确定以此作为研发对象。1978年7月～9月在海南临床初试成功，由云南昆明制药厂试生产。1992年和1996年获胶囊剂及其预防血吸虫病新适应症，又于1997年再获片剂的新药证书。
 

       青蒿琥酯 1977年6月，广西桂林制药厂刘旭开展了青蒿素衍生物的合成研究。同年8月，他们在青蒿素的还原反应中，以硼氢化钾代替硼氢化钠，合成了双氢青蒿素的琥珀酸半酯（即青蒿琥酯），鼠疟的抗疟效价高于青蒿素。1987年4月青蒿琥酯原料药及其注射剂获新药证书。1988年再获片剂新药证书。
 

以青蒿素为基础的复方制剂研发
 

        鉴于青蒿素类单一化合物对疟疾具有速效、高效、低毒、代谢快等特点，但仍易复燃。1982年下半年，中国军事医学科学院五所周义清等认为，如选择另一类代谢较慢的抗疟药物与之配伍，可互补增效、更好杀灭原虫、延缓抗性产生，提出合并用药延缓青蒿素抗性产生的设想。
 

       1984年，军事医学科学院五所周义清与宁殿玺等将苯芴醇（该所创制的另一抗疟新药）与蒿甲醚组成复方即复方蒿甲醚片（Coartem）。1992年4月获我国新药证书和国际专利，现已在全球包括美国在内的86个国家或地区注册。
 

       此外，1991年，军事医学科学院五所李福林、焦岫卿课题组研制复方磷酸萘酚喹片（ARCO），2005年由昆明制药集团进行国际多中心临床试验，并获20余个国家注册许可。1991年～1995年，广州中医药大学李国桥抗疟研究团队研制的双氢青蒿素磷酸哌喹片（Artekin，Duo-Cotexin科泰复），2003年1月获我国新药证书。2003年，李国桥的科研团队研制的青蒿素哌喹片（Artequick粤特快），2006年4月获我国新药证书，在10余个国家注册销售。
 

挽救了数百万人的生命
 

        1981年10月6日，由卫生部中医研究院时任院长季钟朴负责筹办，以青蒿素为专题的第4次联合国开发署、世界卫生组织疟疾化疗科学工作组会议在京召开。屠呦呦等分别就青蒿素化学、药理、毒理、代谢、临床和衍生物等6个方面作了报告，我国首次向国际组织较全面、系统地介绍了青蒿素的研究成果。会议高度肯定了我国发现青蒿素的重要意义，并认为由于它的独特结构及抗疟作用方式与已知抗疟药毫无雷同，为今后设计合成新抗疟药提供了新途径。
 

       2003年，我国创制的青蒿素、蒿甲醚、青蒿琥酯、双氢青蒿素的原料药及其制剂被列入世界卫生组织《国际药典》第3版。青蒿素类药物单一用药和以青蒿素为基础的复合治疗逐步推广应用于全球主要疟区。
 

        由于我国青蒿素、青蒿素衍生物和以青蒿素类为基础的复方制剂的成功研发，及世界卫生组织对青蒿素为基础的联合疗法（ACT）的推动和促进，21世纪开始，全球有疟疾流行的国家或地区陆续使用 以ACT疗法治疗。2005年全球公共和私人机构采购ACT药物0.11亿人份（“人份”指一位患者一个疗程的用药量），2010年采购量上升到1.80亿人份，2012年为3.31亿人份，2014年达3.37亿人份。近些年，全球青蒿素原料药每年消耗量在180吨上下。
 

       在世界卫生组织2015年《世界疟疾报告》发布会上，世界卫生组织全球疟疾计划负责人阿隆索（PedroAlonso）博士指出：“目前世界上治疗疟疾的最有效药物为青蒿素，由中国女药学家屠呦呦于1972年发现并成功提取。青蒿素的使用，成功地降低了疟疾患者的死亡率。”
 

国内外大奖激励创新正能量
 

        抗疟新药青蒿素及其衍生物的发现及其应用，受到我国政府高度评价。        1978年3月，将“全国科学大会奖”分别授予卫生部中医研究院中药研究所、山东中医药研究所/山东省寄生虫病研究所、云南药物研究所；将国家发明二等奖授给以卫生部中医研究院中药研究所为首的6个主要发明单位。以后，青蒿素的衍生物双氢青蒿素、蒿甲醚、青蒿琥酯，分别获得1992年全国十大科技成就、1996年国家发明二等奖、1989年国家发明三等奖；青蒿素复方和复方蒿甲醚，分别获得2006年和2007年的国家科技进步二等奖；青蒿素的人工合成和蒿甲醚预防血吸虫病的新适应症研究，分别获得1987年国家自然科学二等奖和2001年国家科技进步二等奖。
 

         2011年，由于青蒿素的发现，屠呦呦研究员获美国拉斯克基金会的临床医学奖，该奖被视为国际生物医药领域重大奖项。2015年10月，屠呦呦又以“从中医药古典文献中获取灵感，先驱性地发现青蒿素，开创疟疾治疗新方法”，获得世界影响力最大的自然科学奖项——瑞典诺贝尔生理学或医学奖。她是第一位获得自然科学诺贝尔奖的中国本土科学家，第一位获得诺贝尔生理学或医学奖的华裔科学家。2017年,国务院授予屠呦呦国家最高科学技术奖。2019年，屠呦呦荣获中华人民共和国最高荣誉勋章——“共和国勋章”。

 

 

内容来源：中国中医药报